在体研究神经连接与活动是理解大脑功能的基础。鉴于大脑厘米级的尺寸与三维神经回路动态特性，深组织高速体积成像成为脑科学研究的重要需求。双光子显微镜凭借亚微米空间分辨率、固有的光学切片能力及深组织穿透特性，已在神经科学领域占据独特地位。然而，当前双光子显微镜通常依赖缓慢的轴向扫描进行体积成像，且最大穿透深度仅约1毫米。本研究中，我们通过将梯度折射率透镜与可调声学梯度折射率透镜集成至双光子显微镜系统，显著提升了成像穿透深度与体积成像速率。具体而言，长度约1厘米的Grintech梯度折射率透镜可实现从小鼠大脑任意目标区域传导图像，而可调声学梯度折射率透镜通过100千赫至1兆赫的轴向扫描提供亚秒级体积成像速率。该技术能以亚细胞级和亚秒级时空分辨率研究厘米级深部脑区的钙动力学，为探索深部脑功能连接组开辟了新路径。
一、引言
大脑堪称最复杂的器官，其三维神经回路可跨越毫米至厘米尺度并持续产生脉冲活动。然而，即便自高尔基和卡哈尔时代历经百余年研究，我们对于脑回路功能的理解仍远未完善，这主要受限于缺乏能在活体大脑任意位置以三维亚细胞分辨率研究神经连接与活动的合适工具。技术挑战不仅涉及穿透深度，还包括神经网络成像速度。哺乳动物大脑尺寸通常达厘米级，小鼠脑中约95%神经元分布于浅层皮质区之外。此外，数百万神经元相互连接形成复杂的三维网络，其电信号与化学信号动态变化处于毫秒至秒量级。因此，开发兼具厘米级穿透能力与高速体积成像功能的脑成像技术具有迫切需求。
展开剩余92%在神经科学的厚组织细胞观测中，双光子显微镜已成为主流成像技术。该技术具有多重优势：首先，它能以亚微米空间分辨率呈现神经元结构；其次，其非线性特性提供固有的光学切片能力，可在厚样本中实现高对比度观测；第三，双光子显微镜通常采用近红外光，在生物组织中散射较弱且损伤更小，从而支持深部活体成像。然而由于脑组织强散射特性，双光子显微镜在小鼠脑中的典型穿透深度不足1毫米，难以覆盖皮层下结构。
为实现深部脑区的光学显微观测，多种技术方案应运而生。一种策略是通过集成再生放大器提升激发功率与弹道光子数，从而在新皮层实现约1毫米深组织成像。另一种方法是利用长波长（1300纳米或1700纳米）三光子信号，该波段受组织散射影响较小，可将穿透深度提升至1.2毫米。近期采用高功率长波长激光光源更可实现1.5毫米深度成像。但1至1.5毫米的穿透深度仍远未达到全脑穿透水平，若要抵达小鼠脑内任意目标区域，机械侵入手段仍属必要。
当前，内窥镜技术是以最小侵入性实现深部组织成像的最实用方法之一。通过植入细杆状梯度折射率透镜，可在数毫米深度研究神经回路功能，该技术已应用于单光子与双光子内窥镜系统。尽管单光子内窥镜能实现神经动态的高速成像，但缺乏光学切片能力及易受散射干扰的特性限制了其在跨多层分布的神经回路三维成像中的应用。而双光子内窥镜凭借固有光学切片特性，适用于厚脑区的三维成像。发展体积型双光子内窥镜正成为新兴趋势，但现有系统存在轴向扫描速度不足或轴向对比度较低的问题，难以分辨轴向重叠的多个神经元的快速响应。
本研究通过将可调声学梯度折射率透镜集成至双光子内窥镜系统，实现了高轴向对比度下的快速轴向扫描。这套复合透镜双光子内窥镜系统能以高对比度亚秒级体积速率对厘米深度脑区神经回路进行活体成像，在毫秒级时间分辨率下研究三维神经回路瞬态响应方面展现出巨大潜力。
二、材料与方法
01.显微镜系统搭建
高速体积双光子内窥镜成像系统由自主搭建的双光子显微镜、可调声学梯度折射率透镜及梯度折射率透镜构成，如图1所示。采用可调谐飞秒脉冲钛宝石激光器作为双光子激发光源。激光束先通过扩束透镜组，随后经振镜扫描器实现光栅扫描。扫描光路通过扫描透镜与管透镜传递至物镜。在扫描透镜与管透镜之间设置二向色分束镜，用于分离激发光束与背向收集的荧光光子。管透镜后方，将可调声学梯度折射率透镜直接置于物镜上端，实现焦点的高速轴向扫描。通过手术植入小鼠脑内的8毫米长Grintech梯度折射率透镜与物镜精确对准。扩束系统用于控制光束尺寸在可调声学梯度折射率透镜的有效孔径范围内，同时通过适度欠填充物镜以匹配梯度折射率透镜像侧数值孔径，避免耦合损耗。扫描激光束经梯度折射率透镜传导至小鼠脑深部激发双光子荧光，荧光信号由同一梯度折射率透镜、物镜、可调声学梯度折射率透镜、管透镜及二向色分束镜背向收集至光电倍增管模块。光电倍增管前安装成像透镜以汇聚荧光信号至探测区域，并在成像透镜与光电倍增管间设置带通滤光片以阻挡残余激发光子。
图1. GRIN+TAG透镜双光子内窥镜成像系统。插图：成像过程中，通过头板与适配器将植入棒状GRIN透镜的小鼠头部固定于头部固定装置。
02.荧光微球样品制备
采用荧光微球作为初步测试样品。为表征梯度折射率透镜的空间分辨率、扩展景深及视场性能，将500纳米直径黄绿色荧光微球稀释10⁴倍后分散于0.4%琼脂糖水凝胶中进行成像。为模拟神经元三维观测，使用10微米直径荧光微球（未稀释）进行实验。
香港星云先进技术有限公司（NAT）是Grintech亚洲代理商，我们为客户提供梯度折射率透镜（GRIN透镜）等光学产品。
03.小鼠样本制备
实验选用三月龄雌性Ai96转基因杂合小鼠（GCaMP6s报告基因）。通过腺相关病毒2.9载体递送cre重组酶激活GCaMP6s基因表达。所有动物实验均遵循研究机构动物伦理委员会批准的实验动物护理与使用指南。以下依次说明病毒注射与梯度折射率透镜植入手术及成像操作流程。
在病毒注射与透镜植入手术中，先将小鼠固定于立体定位手术平台。全程使用吸入式麻醉：诱导期采用5%异氟烷通气2分钟，维持期采用1-1.5%异氟烷（流量分别为1升/分钟与0.2升/分钟），麻醉剂量参照美国国立卫生研究院镇痛麻醉处方指南。剃除小鼠头部毛发后，沿头皮作1厘米切口并暴露颅骨。在目标位置钻取1.5毫米骨窗用于透镜植入，两侧顶骨各钻0.8毫米骨孔用于固定锚定螺钉。以300纳升容量在10分钟内向右侧视交叉上核注射腺相关病毒2.9-cre病毒，注射速率由微量注射泵与5微升汉密尔顿玻璃注射器控制。
病毒注射完成后进行梯度折射率透镜植入。通过定制夹具将透镜牢固固定于立体定位仪，设定视交叉上核坐标后，以约1厘米/小时的缓慢速度将透镜逐步插入小鼠脑组织以防组织压缩。止血处理后，将定制不锈钢头板安装于颅骨表面，使用牙科水泥将透镜、保护环及头板整体包覆固定于颅骨与锚定螺钉。最后用自制塑料保护帽覆盖透镜防止损伤与污染。术后单独饲养至少两周恢复期。
成像实验前，通过腹腔注射氯胺酮与赛拉嗪实施全身麻醉，剂量分别为100毫克/千克与135毫克/千克。待动物完全麻醉后，取下保护帽并用99.5%乙醇及气流清洁透镜表面。通过头板与定制适配器将小鼠固定于头部固定装置，该装置安装于三维平移台，可实现与显微镜物镜的倾角及空间位置精准对准。
04.体积图像重建与数据流处理
光电倍增管探测的双光子荧光信号经以下步骤处理重建体积图像：首先通过电流-电压放大器以50分贝增益放大信号；随后由数字化仪转换为数字信号；接着在现场可编程门阵列模块中对八个脉冲信号进行平均处理以提升单个体素信噪比；最终将体素数据流传输至固态硬盘存储。
为从体素数据重建体积图像，需实现可调声学梯度折射率透镜与振镜扫描的同步采样。如图2所示，本系统采用飞秒激光脉冲序列作为数字化仪的外部采样时钟。可调声学梯度折射率透镜以70千赫兹正弦波驱动，同步产生的TTL触发信号作为像素触发控制振镜扫描，确保像素驻留时间与透镜振荡周期严格一致。在两触发信号间隔内，激光焦点完成两次轴向扫描采集约1140个数据点，经平均与重采样处理生成73个体素。振镜扫描参数设置为每行128像素、每帧128行。通过定制MATLAB程序可重建128×128×73三维图像。
图2. 体积图像重建的信号流程图，展示了同步数据采样、TAG透镜的TTL触发信号与振镜扫描触发信号的协调关系。
三、结果
01.梯度折射率透镜的空间分辨率
图3(a)与图3(b)分别展示了500纳米荧光微球的成像结果及其沿横向与轴向的强度分布曲线（基于8个微球的平均数据）。图像采集自梯度折射率透镜视场中心区域，各微球强度已按最大值归一化。红色曲线为两条强度分布的高斯拟合结果，显示表征空间分辨率的半高全宽值在横向为1.03±0.06微米，轴向为10.64±0.70微米。
图3. 通过500纳米直径荧光微球成像获取的双合式1毫米直径梯度折射率透镜横向与轴向点扩散函数。(a)与(b)分别为沿横向与轴向的平均强度分布所代表的典型点扩散函数。比例尺：1微米。
02.扩展景深测量
图4. 采用500纳米荧光微球测量的扩展景深。（上）显示轴向强度曲线与对应的xz平面图像，（下）展示不同截面的xy平面图像、对应横向强度曲线及视场范围。比例尺：xz图像10微米，xy图像1微米，视场图像100微米。
扩展景深测量方法与轴向分辨率测量相似，但需开启可调声学梯度折射率透镜。当该透镜工作时，激发激光焦点在每个像素点沿z轴扫描，从而在逐像素基础上形成扩展景深。根据先前研究，扩展轴向强度曲线的长度被定义为扩展景深范围。
图4展示了扩展景深测量结果，包含xz平面图像、对应轴向强度曲线及视场范围。可调声学梯度折射率透镜前入射光束直径为7毫米，因此其产生的相位分布可近似为抛物线型。红色曲线显示哑铃状强度分布，其长度约165微米，该值决定了体积图像的厚度。该强度分布曲线也可作为体积图像信号校准的依据。扩展景深端点（绿色）、中心点（黄色）及另一端点（蓝色）截面的xy强度曲线同时呈现，显示横向半高全宽分别为1.09、1.47和1.22微米。横向分辨率轻微下降可能源于梯度折射率透镜的双折射效应，但整体仍满足大多数细胞成像应用需求。
文献指出，梯度折射率透镜在不同焦深下的视场可能受轴外像差限制。因此通过测量视场来表征成像体积尺寸，测量方法与横向分辨率测定类似，但将振镜设置为最大范围扫描。测量过程中保持透镜与微球样本相对位置固定，通过调节物镜与透镜间距实现不同焦深聚焦。依据既定标准获取各深度视场数据。
如图4底部三组图像所示，视场直径约350微米，在不同焦深下基本保持稳定。相较于理论值（380微米），实测视场约缩小13%。尽管自适应光学技术可能进一步提升，当前各焦深视场已足够覆盖多数深部脑核团，例如尺寸约200×200×200立方微米的视交叉上核。
03.体积内窥成像应用实例
在完成分辨率与成像体积表征后，以下展示高速体积内窥系统在监测生物组织动态方面的两项代表性应用：一是捕获模拟血流的荧光微球流速；二是实现对位于小鼠脑底部视交叉上核神经元活动的活体功能成像。
0301.荧光微球模拟血流
图5显示10微米荧光微球在管内向右流动的时序图像系列，模拟血细胞流动或细胞微流体系统动态。这些图像证明系统达到约4赫兹体积成像速率，其空间分辨率足以清晰分辨单个细胞。高时空分辨率使我们能测定微球流速约为15微米/秒。
图5. 流动的10微米荧光微球三维时序图像代表帧。各子图中白色箭头指示微球流动方向。体积尺寸：长度约180微米，宽度约180微米，高度约165微米。
0302.活体小鼠深部脑区神经元体积功能成像
图6. 头部固定的麻醉小鼠视交叉上核神经元活动活体功能成像。(a) 小鼠脑切片显示梯度折射率透镜与视交叉上核的相对位置。比例尺：1毫米。(b) 三维重建图像的xy视角与(c) xz视角，时间分辨率为0.25秒。插图显示约10微米大小的神经元。成像体积约180×180×165立方微米，插图比例尺：10微米，色标表示归一化荧光强度值。(d) 展示通过钙瞬变ΔF/F测量的(b)图中圆形感兴越区域内神经元活动信号。
图6展示了头部固定麻醉小鼠视交叉上核自发神经元活动的活体功能成像。图6(a)为小鼠脑切片图像，显示梯度折射率透镜与视交叉上核（黄色区域）的相对位置，证实了通过植入梯度折射率透镜实现"深部脑成像"的技术效果。图6(b)与6(c)呈现了GCaMP6标记的视交叉上核体积图像（动态功能响应见影像资料2）。成像体积接近200×200×200立方微米，足以覆盖小鼠单侧大脑半球的大部分视交叉上核区域。图6(c)插图中突出展示了单个神经元的清晰图像。需指出的是，在图6(b)与6(c)的某些区域未能解析出单个神经元，可能源于这些区域标记密度过高。在成像体积内，研究人员手动选取了六个感兴越区域（白色圆圈标示）。图6(d)显示了这些区域的钙瞬变信号。ROI 1和2呈现爆发式神经响应，ROI 3和4的响应随时间逐渐增强，ROI 5显示钙信号轻微衰减，而ROI 6几乎无响应。这种响应模式的多样性表明观测到的荧光变化源于真实神经活动而非运动伪影。
四、讨论
图3数据显示，本内窥镜系统的横向与轴向分辨率分别约为1微米和10微米。与数值孔径0.5的梯度折射率透镜理论值相比，实测半高全宽值分别增大了51.5%和79.1%。表1列出了近期基于数值孔径0.5梯度折射率透镜的内窥镜文献分辨率数据。值得注意的是，多数研究结果同样显著高于理论预测值。梯度折射率透镜的分辨率不足可能源于球面像差或双折射效应，已有研究提出采用自适应光学或梯度折射率透镜级联方案来提升空间分辨率。
表1. 梯度折射率透镜空间分辨率对比
值得注意的是，图4数据显示不同焦平面下的横向半高全宽存在差异（1.09微米至1.47微米）。类似现象在文献[19]中亦有报道，使用同型号梯度折射率透镜时观察到横向分辨率约30%的衰减（见该文献图4C，4号透镜）。有趣的是，该文献图2C显示轴向半高全宽在不同焦平面保持恒定（约12微米），与横向分辨率变化无相关性。这些结果表明，梯度折射率透镜在不同焦平面的横向分辨率确实会降低，但轴向分辨率保持稳定。其根本原因可能是横向分辨率下降由透镜的双折射效应引起。如参考文献图3所示，双折射可能导致横向形成双焦点，但不会影响焦点的轴向长度。这也解释了图4中间面板中点扩散函数形态为何轻微倾斜，以及图6(c)插图中为何能在xz平面清晰观察到单个神经元。
对于需要高分辨率的內窥镜研究，需注意其分辨率由梯度折射率透镜的数值孔径决定，而非物镜数值孔径。已有研究报道通过在透镜端面附加高数值孔径微透镜可显著提升分辨率，但微透镜会引入额外的放大倍率，导致视场缩小。同时，由于扩展景深与放大倍率成反比，成像体积厚度也会相应缩减。此外，高数值孔径梯度折射率透镜因装配需求通常直径大于1毫米。要实现低侵入性的大体积成像，需要同时满足高数值孔径（>0.7）、低放大倍率（<2倍）和小直径（<1毫米）三个关键参数，这对透镜设计提出巨大挑战。本研究选择的透镜方案以适度侵入性实现了足够覆盖视交叉上核的成像体积。
图6展示了在小鼠脑部6毫米深度的视交叉上核活体体积功能成像。然而由于轴向快速扫描导致体素驻留时间仅100纳秒，ΔF/F轨迹的信噪比尚未达到最优。可能的改进方案包括采用更明亮的荧光染料（如GCaMP7），或在采集电路中增加积分器以提升信噪比。
此外，本研究所开发的复合透镜双光子内窥镜技术具有更广泛的应用潜力。在脑科学研究中，除位于脑底部的视交叉上核外，海马体、杏仁核与黑质等深部脑区均可通过该系统进行观测。除神经系统外，该技术还可应用于其他动态生物系统研究，如肌肉收缩与血流监测等。图5已演示了模拟血细胞流动的荧光微球成像实验。基于本系统最大成像体积（约350×350×165立方微米）与时间分辨率（约4赫兹体积速率），可测量的最大流速约1500微米/秒。研究人员的研究估算小鼠红细胞在可比视场与时间分辨率下的流速约600微米/秒，表明本技术完全具备深部脑区血流速度监测能力。
五、结论
本研究通过将梯度折射率透镜与可调声学梯度折射率透镜集成至自主搭建的双光子显微镜，成功开发出一套新型双光子体积内窥镜成像系统。该创新技术能够以高对比度亚秒级体积成像速率，实现对厘米深度小鼠脑区神经元的活体观测。
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